蜂花粉是由蜜蜂采集植物花粉，加人一些花蜜和唾液发酵而成的花粉团。蜂花粉是最完美的全营养食品之一，富含蛋白质，包含了人体所需的全部必需氨基酸，此外还有碳水化合物、脂质、糖类、纤维素、维生素和矿物质。现代研究表明，蜂花粉具有抗氧化、抗菌、增强免疫、抗过敏等多种功效。枸杞蜂花粉中可溶性糖质量分数为44.8%，蛋白质质量分数为25.0%，每克枸杞蜂花粉中含有总多酚22.95mg没食子酸当量，总黄酮21.17mg芦丁当量，氨基酸总质量分数为21.62%～22.08%。已报道枸杞蜂花粉醇提物有一定抑制前列腺增生的作用，枸杞蜂花粉多糖能够显著促进短链脂肪酸的产生并调节肠道菌群，能够很好地抑制前列腺癌DU细胞的增殖，但关于枸杞蜂花粉多糖的提取工艺报道极少。枸杞蜂花粉的多糖具有潜在的生物活性，为了进一步研究枸杞蜂花粉多糖，选择高效的提取方法尤为重要，但相关研究报道鲜见。花粉多糖一般采用热水提取、乙醇沉淀的方法获得，宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所的米佳、禄璐、罗青、张志娟、李晓莺、闫亚美、曹有龙，北方民族大学生命学院的杨雪莲采用了传统的水提醇沉法优化枸杞蜂花粉多糖的超声波辅助提取工艺，并考察其抗氧化活性，为枸杞蜂花粉多糖的功效研究和产品开发提供理论依据和技术参考。
1材料与方法
1.1材料与试剂
枸杞蜂花粉，收集于宁夏银川市园林场枸杞基地；葡萄糖(GC99.5%)、ABTS(HPLC≥98%)、TPTZ(HPLC≥98%)，美国Sigma-Aldrich公司；DPPH(HPLC≥98%)，东京化成工业株式会社；维生素C(纯度99%)，北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2仪器与设备
BSS型分析天平，德国赛多利斯公司；TU型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；CentrifugeR型冷冻型台式大容量高速离心机，德国艾本德公司；全数字超声波发生器，武汉嘉鹏电子有限公司。
1.3实验方法
1.3.1枸杞蜂花粉多糖的提取
称取一定量的枸杞蜂花粉粉碎，用80%乙醇除去色素，抽滤至干后加入一定体积的蒸馏水超声提取，离心取上清液，加入4倍体积无水乙醇醇沉过夜，离心(r/min，10min)后取沉淀即为粗多糖[15]。
1.3.2多糖含量的测定
以不同浓度的葡萄糖做标准曲线进行分析测定[16]。标准曲线方程为：y=1.x-0.(R2=0.，线性范围0～0.7mg/mL)。同法测定枸杞蜂花粉粗多糖的含量，按标准曲线计算浓度，见式(1)。
多糖得率=(c×f×V)/m×%，
(1)
式(1)中，c为测定样液的质量浓度,mg·mL-1；f为稀释倍数；V为提取体积,mL；m为枸杞蜂花粉质量,mg。
1.3.3单因素实验
取一定量的花粉，除去色素后按下列条件进行单因素实验：在温度70℃、超声功率W条件下，分别以料液比(g/mL)1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35提取30min；以料液比(g/mL)1∶25，固定超声功率W，分别在50、60、70、80、90℃温度条件下提取30min；以料液比(g/mL)1∶25，固定提取温度70℃，分别在、、、、W的超声功率条件下提取30min；以料液比(g/mL)1∶25，在超声功率W、提取温度70℃条件下，分别提取10、20、30、40、50min。每组实验均平行3次，考察单因素对枸杞蜂花粉多糖提取得率的影响。
1.3.4响应面试验设计
在单因素实验的基础上，选择料液比、提取时间、提取温度、超声功率为自变量，以得率为响应值，根据Box-Behnken设计原理，采用四因素三水平响应面分析法进行试验设计，优化超声提取枸杞蜂花粉多糖的提取工艺，因素与水平设计见表1。
表1响应面试验设计因素与水平
1.3.5体外抗氧化活性测定
1.3.5.1ABTS+自由基清除能力测定
参照文献[17]方法，以不同浓度的维生素C对ABTS+自由基清除率做标准曲线，结果表示为每克干物质的维生素C当量(μmol/mg)，见式(2)。
ABTS+自由基清除率=1-A1/A0×%，
(2)
式(2)中，A0是对照的吸光度值(即以水代替样品)，A1是样品的吸光度值。
1.3.5.2DPPH自由基清除能力测定
参考文献[18]方法，以维生素C溶液清除DPPH自由基清除率作标准曲线，结果表示为每克干物质的自由基当量(μmol/mg)，见式(3)。
DPPH自由基清除率=(A加样前-A加样后)/A加样前×%。
(3)
1.3.5.3FRAP值的确定
参考文献[19]方法，以维生素C溶液作标准曲线，结果表示为每克干物质的维生素C当量(μmol/mg)。
2结果与分析
2.1单因素实验结果
不同小写字母表示差异显著(P0.05)。图1单因素实验结果
单因素对枸杞花粉多糖得率的影响如图1。单因素实验结果表明，随着料液比的增加，枸杞蜂花粉多糖得率呈明显的上升趋势，当料液比达到1∶25时，多糖得率最高，但继续提高料液比使多糖的得率下降(图1(a))。当温度在50～60℃时，枸杞蜂花粉多糖的得率增长不显著，继续升高提取温度至90℃时，多糖得率不断提高，且差异显著(图1(b))。超声功率为W时的多糖得率最低，W时多糖得率最高，且与其他功率条件下的多糖得率差异显著，但继续增大超声波的功率使得多糖得率降低(图1(c))。在10～20min的提取时间范围内，多糖得率呈上升趋势，在20min时达到最大，但差异不显著，再延长超声提取时间则使多糖得率迅速下降(图1(d))。这是因为增大溶剂用量能使植物细胞和外部溶剂之间产生更大的浓度差，有利于多糖的迅速扩散和溶出，但较高的溶剂用量会导致原料的物质分子间相互作用减弱[20]。高温能够提高传质速度且增加多糖的溶解度，同时对花粉细胞壁起到一定的破坏作用，利于多糖的浸出[21]。超声波功率的增加能够加快提取液的振动，对细胞壁的破坏力加大，有利于有效成分的浸出，提高了多糖得率；但超声功率过大或者超声时间过长会造成多糖的结构或性质的改变，如降解为单糖等物质，降低了多糖得率[12]。因此选择料液比(g/mL)1∶20至1∶30，提取温度85～95℃，超声功率～W，提取时间10～30min，进行响应面试验。
2.2响应面试验结果
2.2.1Box-Behnken试验设计及结果
根据单因素实验结果，选取料液比、提取温度、超声功率和提取时间进行四因素三水平的Box-Behnken试验设计，结果如表2。
2.2.2回归模型有效性及显著性分析
利用Design-Expert8.0.6软件对表2响应面方案及结果进行回归拟合分析，对回归模型进行方差分析，并检验回归方程系数的显著性，结果如表3。
分析建立的四因子数学回归模型见式(4)。
Y=0.89-0.A+0.B+0.C-0.D-0.AB-0.AC-0.01AD-0.BC+0.01BD+0.CD-0.A2-0.B2-0.C2-0.D2。
(4)
由表3可看出，整体模型极显著(P0.)，失拟项不显著(P0.1)，模型的决定系数R2为0.，校正后决定系数值为0.，说明选用的模型与实际情况拟合较好，能较好反映出各因素与枸杞蜂花粉多糖得率之间关系。A、AB、AC、BC、CD都不显著(P0.05)，将这5项从回归模型中删除，最终回归模型见式(15)。
Y=0.89+0.B+0.C-0.D-0.01AD-0.01BD-0.A2-0.B2-0.C2-0.D2。
(5)
表2Box-Behnken试验设计及结果
表3Box-Behnken试验结果方差分析
**表示差异极显著(P0.01)；*表示差异显著(P0.05)。
2.2.3响应面分析
各因素交互作用对枸杞蜂花粉多糖得率的影响响应曲面分析结果见图2。其中等高线的形状可直观地反映出交互效应的强弱，圆形表示2个因素间交互作用不显著，椭圆形表示2个因素间交互作用显著[22]。
图2各因素交互作用对枸杞蜂花粉多糖得率影响的响应面图
由表3可知，料液比和超声时间、超声温度和超声时间的交互作用能显著影响枸杞蜂花粉多糖的得率(P0.05)。由图2(a)响应面分析结果可知，当提取温度为90℃，提取功率为W时，随着料液比和提取时间水平的上升，多糖得率成缓慢上升趋势，在料液比(g/mL)1∶24至1∶26、提取时间19～21min内，多糖的提取得率最高。如图2(b)，当料液比为(g/mL)1∶25，提取功率为W时，随着提取温度和提取时间的上升，多糖提取得率迅速提高，当提取温度为89～91℃，提取时间为19～21min，多糖的得率最高。随后，随着提取温度和提取时间的降低，多糖得率呈现下降趋势。
2.2.4验证实验结果
通过回归模型的分析，枸杞蜂花粉多糖的优化提取工艺条件为料液比为(g/mL)1∶24.83、提取温度为90.96℃、超声功率为.65W、提取时间为19.85min时，枸杞蜂花粉多糖得率最高，达0.90%。考虑到实际操作方便，将工艺条件修正为料液比(g/mL)1∶25、超声功率W、提取温度90℃、提取时间20min。在此条件下，枸杞蜂花粉多糖得率为0.89%～0.91%，实际值与理论值基本相符，说明该工艺条件稳定可靠，具有可行性。
2.3枸杞蜂花粉多糖的体外抗氧化活性分析
ABTS+自由基能够被抗氧化剂提供的电子或氢原子灭活，使溶液发生颜色变化，再通过该变化检测抗氧化物质的抗氧化活性[23]。维生素C浓度为50～μmol/L时与ABTS+自由基清除能力呈线性相关，线性方程为y=0.x+0.(R2=0.)。计算得到枸杞蜂花粉多糖的ABTS+自由基清除力为(0.±0.)μmol/mg。DPPH自由基是一种较为稳定的自由基，广泛应用于抗氧化成分的抗氧化活性评价[24]。浓度为25～μmol/L的维生素C与DPPH自由基清除力呈线性相关，线性方程为：y=0.x-0.(R2=0.)。计算得到枸杞蜂花粉多糖的DPPH自由基清除力为(0.44±0.09)μmol/mg。FRAP值反映了抗氧化剂还原能力的大小[25]。浓度为25～μmol/L的维生素C与FRAP值呈线性相关，线性方程为y=0.x+0.(R2=0.)。计算得到枸杞蜂花粉多糖的FRAP值为(0.07±0.00)μmol/mg。枸杞蜂花粉多糖具有较好的清除ABTS+自由基和DPPH自由基的能力，但FRAP值较低。
3结论
研究优化了超声辅助提取枸杞花粉多糖的工艺，当提取条件为料液比(g/mL)1∶25、提取温度90℃、超声功率W、超声时间20min时，枸杞花粉多糖的得率达到0.89%～0.91%；并研究了枸杞花粉多糖体外抗氧化活性，其对于ABTS+自由基清除力、DPPH自由基清除力和FRAP值分别为0.19、0.44、0.07μmol/mg，表明其具有较好的DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力，但FRAP值较低。
参考文献：略（可点击原文查看）
引用格式：米佳，杨雪莲，禄璐，等.枸杞蜂花粉多糖超声波提取工艺优化及抗氧化活性分析[J].食品科学技术学报，2,38(1):97-.MIJia,YANGXuelian,LULu,etal.Ultrasound-assistedextractionoptimizationandanalysisofantioxidantactivitiesofpolysaccharidesfrombeepollenofwolfberry[J].JournalofFoodScienceandTechnology,2,38(1):97-.
基金项目：宁夏农林科学院先导资金资助项目(NKYJ-18-22；NKYG-19-06)；宁夏回族自治区全产业链项目(QCYL--05)。
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