KeyLaboratoryofBiodiversityFormationMechanismandComprehensiveUtilizationofQinghai-TibetanPlateauinQinghaiProvince

概述

OVERVIEW

NeuralRegenerationResearch(IF=3.)刊载了一篇由广州再生医学与健康广东实验室林松团队年9月14日发表的名为Lyciumbarbarumpolysaccharide-glycoproteinpreventativetreatmentamelioratesaversive的文章。研究表明枸杞多糖糖蛋白是抑郁症的潜在预防性干预，并可能通过预防外侧缰核的异常神经元活性和微胶质活化来作用。

前言TNTRODUCTION

抑郁症是最常见的精神障碍类别，影响世界大约16%的人口，并且与高自杀风险有关。它的临床症状，包括社交能力受损，神经性障碍，行为绝望和焦虑。尽管取得了重大进展，但大多数治疗抑郁症的现行医疗疗法在许多患者中仍然无效，往往造成难以忍受的副作用。因此，迫切需要了解抑郁症的基本机制，并找到新的策略，以改善目前的治疗。

大量证据表明炎症在抑郁症的病理生理学中起着重要作用。先前使用抑郁症自杀受害者死后脑样本进行的研究表明，前炎细胞因子的基因表达率升高。此外，向非抑郁个体中给发炎细胞因子（例如干扰素-α）或细菌内毒素脂质糖会导致炎症反应和抑郁症状。传统的抗抑郁药物，包括选择性血清素再摄取抑制剂、血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂，通过增加单胺作用，从而改善脂多糖诱导的抑郁样行为和刺激反应。总之，这些研究表明炎症与类似抑郁症的行为相关，使用抗炎药物可以缓解抑郁症状。巴宝是一种常用的中草药;其主要有效成分是枸杞多糖（LBP）。据报道，LBP具有多种有益的抗癌、免疫调节、肠道微生物群和抗衰老作用。最近的研究发现，LBP通过抗炎和抗氧化特性在各种中枢神经系统疾病中表现出神经保护活性。然而，LBP对抑郁症的影响和潜在机制仍然缺乏了解，推测LBP可以通过抗炎作用改善抑郁症状。

外侧缰核（LHb）是哺乳动物物种中极其保守的大脑区域，在调节抑郁症样行为方面起着关键作用。数据表明，长期接触抗性刺激（AS）可以通过增加LHb的异常神经元活动来增加抑郁样的行为和这增加了微胶质炎症活化。相反，LHb的抑制可缓解抑郁症样行为。然而，LBP能否改善抑郁症状，减少LHb的异常神经元活性和微胶质炎症，仍需要确定。此研究通过行为、电生理和生化分析，研究LBP-糖蛋白（LbGP）的抗抑郁作用及其基础的影响和机制。

方法METHOD

1.材料成年（6~8周大）雄性C57BL/6小鼠用于本研究。所有老鼠都被安置在12小时的光/暗循环下，提供食物和水。对于抑郁症样的行为建立，动物被随机分配到AS（n=10）和对照（n=10）组。对于LbGP治疗试验，小鼠接触长期性AS（n=20），并随机分配接受生理盐水（AS=盐水组，n=10表示SPT和FST测试的两组）;n=9表示OFT测试）或LbGP（AS=LbGP组，n=10表示SPT和FST测试;n=9表示OFT测试）。AS+盐水组的治疗和实验计划动物每天接触AS并接受盐水（0.5mL）。AS+LbGP组的小鼠接触AS并收到LbGP每天灌胃给药。所有组的治疗期为28天。行为测试和电生理记录分别于第29天和第30天进行。长期AS暴露模型建立抑郁症模型是通过接触狐狸尿液、吹气和足部休克和身体约束，每天进行28天。脚冲击暴露动物被放置在一个丙烯酸盒（25厘米×25厘米×40厘米），配备了金属网地板。试间间隔为15~30秒，每个试验随机选择。要设置凹陷鼠标模型，电脚冲击（20次/天，0.6~1mA，ms;中国武汉益红科技有限公司）随机传输。在对照组中，小鼠被放置在相同的丙烯酸盒中，但没有得到任何刺激。2.吹气暴露动物被放置在一个笼子里，空气喷射器（20次/天）被随机激活，试验间间隔从10-15秒。3.狐狸尿液暴露动物被设置在一个透明塑料容器（25厘米×10厘米×10厘米，有孔）包含四个棉球浸泡在红狐尿每天30分钟。在对照组中，老鼠被设置在自己的笼子里，用2mL水代替狐狸尿液。4.身体约束动物被囚禁2小时/天的塑料约束器。约束后，老鼠被放回笼子里。行为测试所有行为测试在28天A暴露后进行，并在光相（7a.m.~7p.m.）期间进行。研究人员在评分过程中被实验组蒙蔽了双眼。5.使用双瓶选择每只动物分别安置了2天。向老鼠提供两个水瓶，一个含有2%蔗糖溶液，另一个含有自来水。每24小时测量一次每只动物的蔗糖和水摄入量。为了避免位置的偏好，每24小时更换一次两个瓶子的位置。蔗糖偏好计算为蔗糖摄入量与总液体摄入量的比率，并将值转换为百分比。6.强制游泳测试小鼠分别放置在一个圆柱体（直径20厘米，高度27厘米）中，在23~25°C下含水，游6分钟。水的深度被设置为防止动物用后肢触摸圆柱体的底部。动物行为被视频跟踪从侧面。两位独立研究人员以盲目的方式量化了老鼠保持不动的时间。7.开场测试运动被计算在一个开放场测试箱（50厘米×50厘米×40厘米）。动物被安置在塑料盒的中心，被允许自由探索15分钟，并使用位于盒子上方的红外摄像机进行视频录制。电机活动和过去10分钟内的中心时间由EthovisionXT软件（Noldus信息）计算。8.免疫细胞化学和图像分析小鼠被麻醉（Avertin，13μL/g，内丙酮注射）和在心脏内用0.9%盐水，其次是4%的半成甲醛在磷酸盐缓冲盐水。大脑被移除并放入试管中。电离钙结合适配器分子1（Iba-1）是微胶质和炎症的特定标记物。对于Iba-1标签，含有LHb的大脑切片用磷酸盐缓冲盐水洗涤5到6次，然后将含有10%正常山羊血清的0.1M磷酸盐缓冲盐水（Vector实验室、Burlingame、CA、CA）和0.3%TritonX-小时，在对伊巴-1（1：）的原抗体孵育前;在4°C下36小时。然后用DyLight山羊抗兔IgG（1：）孵育切片;室温6小时。最后，用0.1M磷酸盐缓冲盐水洗净所有切片，并覆盖有抗褪色水固定介质。切片使用蔡司共合显微镜以20×的图像。对于从微观图像进行三维重建，以0.2μm的间隔获得光学截面。为了确定每个场的Iba-1+细胞数，LHb的中心被放置在蔡司AxiimagerZ2显微镜下，从本研究中使用的每组3个动物（4个部分/动物）的12Iba-1免疫区，并且Iba-1+细胞的数量被计算在每一部分的×80μm区域中。使用ImageJ软件测量Iba-1+细胞的索玛直径，并计算了平均直径。主要微胶质过程的数量在视觉上确定为来自细胞体的主要过程的数量。9.脑片制备和电生理记录动物被麻醉了异氟素，在脑脊液下用振动器切割了一片（毫米厚）脑片，在室温下在人工脑脊液中孵育1小时。孵育后，将含有LHb的单个切片放入浸入含氧人工脑脊液中的记录室。为了记录LHb神经元的传递模式，电极中填充了基于K+的溶液（mM）KMeSO4，10KCl，-（2-羟基乙基）-1-管道乙烷硫酸，10Na2-磷酸酯，4MgATP，0.3Na3GTP在mosm，调整到pH7.4与KOH。从+70mV的膜电位进行去极化电流。在当前夹紧模式下（I=0pA），在电极中测量自发点火。LHb神经元根据其自发的燃烧模式被归类为无声、补品或爆裂。用于录制多氯放大器B放大器，Clampfit10.0软件（分子设备）用于离线数据分析。10.统计分析所有数据都是使用GraphPad棱镜7软件计算出来的。统计显著性设置在P0.05。数据表示均值±（SEM）的标准误差。t-测试用于比较组之间的差异。方差的双向分析使用id?k的多重比较测试来量化Iba-1+细胞的数量、其直径和过程数。奇方测试用于计算突发发射细胞的百分比。

结果RESULT

1.LbGP预防性治疗可改善A-诱导的抑郁症样行为先前的研究发现，长期接触AS可以增强小鼠的抑郁行为。根据这些研究，我们首先让老鼠接触28天的SAS。随后对小鼠进行了一系列行为测试（图1）A。为了检查抑郁症样的行为，我们使用了两种经过验证的抑郁症测定，蔗糖偏好测试和强迫游泳测试。与对照小鼠相比，长期接触SAS的小鼠表现出较少的蔗糖偏好（P=0.;（图1B）表示苯丙尼型水平增加。此外，长期接触SAS的小鼠在强迫游泳测试中表现出显著延长的固定持续时间，表明绝望表型水平增加（P=0.;图1C）。鉴于抑郁症的症状往往伴有焦虑加剧。长期接受AS的小鼠在公开实地测试测试中测试的焦虑样行为也显著增加。相比之下，长期接触AS并没有改变运动活动（P=0.;图1E)。

表示增强的抑郁和焦虑样的行为不是由于异常运动。检查了LbGP治疗是否对长期接触SAS产生的类似抑郁行为产生预防作用。在接触AS（图2）A的28天内，LbGP每天以5mg/kg的浓度进行加夫奇施用，这是以前报告最有效的浓度。我们发现，LbGP预防性治疗显著减少了蔗糖偏好测试和强制游泳测试检查的安红病和行为绝望，分别（P=0.，P=0.;图2B和图2C。LbGP预防性治疗也显著减少了焦虑样的行为（P=0.;图2D）不影响小鼠的运动活动（P=0.;图2E.上述结果表明，LbGP预防性治疗可以改善长期接触AS引起的抑郁和焦虑样行为。

图1.长期接触AS会诱发抑郁症样行为。（A）实验设计的示意图。雄性C57BL/6小鼠首次接触28天的A组（脚部休克，20次/天;吹气，20次/天;狐狸尿液，30分钟/天;身体克制，2~4小时/天），然后是行为评估。（B）长期接触AS后减少小鼠的蔗糖偏好（n=10只动物/组，P=0.）。（C）长期接触AS后小鼠的固定持续时间增加（n=10只动物/群，P=0.）。（D）长期接触A（n=10种动物/群，P=0.）后，在小鼠中中心时间减少。（E）在接触长期AS（n=10种动物/组，P=0.）后，在OFT中测试的总距离没有显著变化。数据表示为±SEM.*P0.05，**P0.01，***P0.（t-测试）。AS：逆境刺激;ns：无显著差异;OFT：开放现场测试。图2.LbGP预防性治疗可减少AS诱发的抑郁症样行为。（A）实验设计的示意图。在接触AS的28天内，LbGP每天由gavage管理，随后进行行为评估。（B）LbGP预防性治疗增加了接触AS的小鼠的蔗糖偏好（n=10只动物/组，P0.0）。（C）LbGP预防性治疗缩短了接触AS的小鼠的固定时间（n=10只动物/组，P=0.）。（D）LbGP预防性治疗增加了在OFT中测试AS暴露的小鼠的中心时间（AS+盐水组中的n=9;n=9表示AS=LbGP组中，P=0.）。（E）在OFT中测试的总距离没有显著变化（AS=盐水组中的9种动物）;n=AS=LbGP组中的9种动物，P=0.）。数据表示为±SEM.*P0.05，**P0.01，***P0.（t-测试）。AS：逆境刺激;FST：强制游泳测试;LbGP：枸杞多糖-糖蛋白;ns：无显著差异;OFT：开放现场测试;SPT：蔗糖偏好测试。2.LbGP对LHb预防性治疗

执行从LHb神经元在切片全细胞记录，以测量他们的神经元兴奋性和发射模式（图3A，发现，长期接触AS显著增加LHb神经元中电流脉冲所激发的动作电位（P0.0;图3B），表示LHb的神经元兴奋性增加。此外，在长期接触AS的小鼠中，LHb中突发发射细胞的百分比和发射频率都显著增加（P0.0或P=0.;图3C）。上述结果表明，长期接触AS增强性抑郁症样行为，并伴有LHb异常神经元活动增加。

图3：长期接触AS会导致LHb的异常神经元活动。（A）左图：实验设计的示意图。右图：LHb神经元记录的代表图像。比例线：30μm.（B）控制和控制片和AS组的电流脉冲引起的作用电位（对照组中三只小鼠的n=9个神经元）;n=来自AS组中三个小鼠的10个神经元，P0.0）。（C）上部：沉默、补品射击和突发发射LHb神经元的代表性痕迹。左下角：对照组和AS组中三种LHb神经元的百分比（n=对照组中四个小鼠的41个神经元）;n=来自AS组中四个小鼠的42个神经元，P0.0）。右下角：突发神经元的自发发射频率。

为了探寻LbGP抗抑郁作用背后的可能细胞机制，研究测量了LHb神经元的神经元兴奋性和激发模式（图4A）。LbGP预防性治疗显著降低了电流脉冲引起的行动电位（P=0.;图4B）和LHb神经元中突发激发的百分比（P=0.，P=0.;（图4C），表明LbGP的预防性治疗不仅可以改善抑郁症状，而且可以减少长期接触AS引起的异常神经元活动。

图4.LbGP预防性治疗抢救LHb神经元的AS诱导异常神经元活动。（A）实验设计的示意图。LbGP每天由gavage在接触AS的28天内进行管理，随后进行电生理记录。（B）AS+盐水和AS+LbGP组小鼠脑片中的电流脉冲引起的作用潜力（AS+盐水组三只小鼠的n=10个细胞）;n=AS=LbGP组中三个小鼠的6个细胞，P=0.）。（C）左：来自AS+盐水和AS=LbGP组的小鼠三种LHb神经元的百分比（N=AS+盐水组中四个小鼠的41个细胞）;n=AS=LbGP组中四个小鼠的39个细胞，P=0.）。右：突发神经元的自发发射频率（n=8个细胞来自三个小鼠的AS+盐水组;n=7个单元格来自三个小鼠的AS=LbGP组，P=0.）。3.LbGP预防性治疗抑制LHb中的微胶质活化

鉴于微胶质与生理学或病理学条件下神经元活动的调节有关，并且在抑郁症和抑郁症动物模型患者中观察到微胶质活化，我们测试了长期接触AS是否会导致LHb中的微胶质激活。我们发现，长期接触AS显著增加细胞直径（P0.0）、细胞数量（P0.0）和过程数（P0.0）Iba-1=LHb（图5A）中的细胞（图5B，图5C，图5D），表明长期接触LS增强微胶质活化在LHb。先前的研究发现，LBP在治疗各种疾病中起到了强大的抗炎和抗氧化作用。测试了使用LbGP的预防性治疗是否可以在LHb中衰减AS诱导的微胶质活化。发现细胞号（控制与.AS=LbGP，P=0.;AS=盐水vs.AS=LbGP，P0.0），直径（控制与.AS=LbGP，P=0.;AS=盐水vs.AS=LbGP，P0.0）和流程编号（控制与.AS=LbGP，P=0.;AS=盐水vs.在LbGP治疗（图5A，图5B，图5C，图5D，Iba-1+LHb细胞的P0.）明显减少。这些结果表明，LbGP预防性治疗也可以减少长期接触AS引起的炎症。

图5.LbGP预防性治疗抑制了AS诱导抑郁小鼠LHb的微胶质活化。（A）LHb中微胶质（Iba-1+，绿色）的代表性数字。（B）LHb中每个微胶质的细胞直径的定量数据：n=每组三只小鼠的29个细胞，P0.0;控件与.AS=盐水：P0.0，控制与.AS=LbGP：P=0.，AS=盐水vs。AS=LbGP：P0.0。（C）LHb中的微胶质细胞数：n=每组三只小鼠的12片，P0.0。控制vs.AS=盐水：P0.0，控制vs.AS=LbGP：P=0.，AS=盐水vs。AS=LbGP：P0.0。（D）LHb中每个微胶质细胞的工艺数：n=每组三只小鼠的30个细胞，P0.0。控件与.AS=盐水：P0.0，控制与.AS=LbGP：P=0.，AS=盐水vs。AS=LbGP：P0.。在目前的研究中，测试了LbGP预防性治疗的抗抑郁作用，并探究了潜在的机制。表明，LbGP预防性治疗显著改善了长期接触SAS引起的抑郁和焦虑样行为。其次，长期接触AS的小鼠在LHb中增强了异常神经元活动，LbGP预防性治疗可能会减弱。最后，长期接触AS的小鼠在LHb中表现出增加的微胶质活化，可以通过同时进行LbGP治疗来预防。结果表明，LbGP可能是抑郁症的潜在预防性干预，可能通过恢复LHb的异常神经元活性和微胶质活化进行调解。

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