本文介绍了CRISPR/Cas9的工作原理，sgRAN设计以及sgRNA表达质粒的构建，还有构建好的CRISPR/Cas9系统如何在细胞中工作和后续如何筛选编辑成功的永久细胞系。
CRISPR全称clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(成簇的规律间隔的短回文序列),该系统功能结构由三部分构成，crRNA,tracrRNA和Cas9（Crisprassociatedprotein）蛋白,后为了便于使用，将crRNA与tracrRNA简化，统称为sgRNA（图1）。Cas9具有两个活性酶切位点，RuvC(D10)和HNH(H)活性结构域，因此野生型Cas9剪切能切断DNA双链，若活性位点突变（D10A，HA）将导致该位点酶切活性缺失（Cas9n和dCas9），CRISPR相关衍生基因编辑工具如CRISPRi,CRISPRa,CRISPRmethylation/demethylation等都是对Cas9改造后与相关作用原件形成融合蛋白发挥作用（该部分内容后续将进行系列报导）。Cas9除了发挥酶切活性，还具有寻靶功能：识别基因组DNA上的PAM序列-NGG。Cas9识别PAM序列，sgRNA识别结合靶序列，构成聚合体后，Cas9行使内切酶功能。Cas9切割位点位于sgRNA第17与第18碱基之间即近3’端PAM序列结合的DNA上。
图1CRISPR/Cas9系统结构示意图
切割形成DSB后,主要进行两种DNA修复（图2），由修复模板介导的精确修复即同源修复(HDR)和非同源修复（NHEJ），前者需要设计修复模板，主要用于敲入、替换或精确敲除，后者用于敲除，修复后可能产生缺失、插入和替换等。且HDR效率较低，如何提高HDR效率当前仍是较为棘手的问题。
图2DSB产生后的非同源修复和同源修复
以上是CRISPR/Cas9简介，接下来将系统性介绍如何运用该技术进行基因编辑。以Cas9-sgRNA共表达质PX(pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX)V2.0)为例，图3为利用CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中进行基因编辑的主要流程图。
图3利用CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中进行基因编辑的主要流程图
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